杨茂林
(农垦宝泉岭分局中心医院，黑龙江 萝北 154211)

关键词：神经干细胞；天门冬
中图分类号：R965    文献标识码：A     文章编号：1008—0104(2009)03—0086—02

    神经干细胞(neural stem cell，NSC)是来源于中枢神经系统的多能干细胞，终身具有自我更新能力，并能分化成神经系统的各类细胞。对神经干细胞的深入研究使人们对神经系统发育、再生和修复有了全新的认识．也给神经系统疾病的治疗带来了希望。分化是神经干细胞研究的重要方面。目前诱导NSC分化的因素尚未完全明了，有关NSC体内外定向诱导分化为神经细胞是近年来的一个研究热点。祖国传统中药中具有滋阴补阳、增智健脑、活血化瘀、抗衰老和调节免疫功能的中药，在神经系统疾病的治疗上有着显著的疗效。我国学者在此基础上，尝试应用中医药学理论，开展中药及其有效成分对神经干细胞增殖分化影响的研究，并取得了一些进展。天门冬作为一种传统中药，临床多取其养阴润燥、清肺生津的功效，用于肺燥干咳、顿咳痰黏、咽干口渴、肠燥便秘等症。近年来人们逐渐认识到其有抗血栓、抗衰老作用，推测其对神经元具保护作用。故本实验对天门冬对神经干细胞分化作用进行研究。
l 材料与方法
1．1 实验动物
    培养神经干细胞所用动物为出生24h之内Wistar大鼠，由佳木斯大学实验动物中心提供。
1．2  药品及试剂
    天门冬水提液：由佳木斯大学药学院提供：DMEM／F12(1：)、B27、购自Gibco公司，EGF、bFGF、Poly—L—Lysine购自Sigma公司．Nestin一抗、NSE一抗、免疫荧光试剂盒、SABC免疫组化试剂盒、DAB试剂盒均购自北京博奥森公司。
1．3 NSC的分离培养及鉴定
    取出新生24h以内的Wistar大鼠，无菌条件下打开颅腔，分离钳取海马组织．用Hank’s液漂洗3次，并移至预先加入适量DMEM／F12培养液的小瓶中。将组织块剪成lmm3左右的小块，吹打制成单细胞悬液。调整细胞密度为5×1O个／mL，接种于25cm2培养瓶中，加入含有bFGF和EGF、B27的MEM／F12培养液．放入37 C、5 CO2、8O% 湿度(HR)条件下CO2培养箱培养。隔2～3d换半量培养液一次，每7天传代一次。将原代和传代培养的神经球涂于Poly—L—Lysine包被的载片上，晾干，4%多聚甲醛固定。抗Nestin免疫荧光化学染色鉴定。
1．4  NSC的诱导分化
    将传3代的神经干细胞球接种于4块6孔培养板(预先放有P01y—L —Lysine处理过的无菌盖玻片)中．每块培养板分1组，对照组为DMEM／F12(1：1)培养液，余下3个试验组分别为DMEM／Fl2(1：1)培养液加入低(0．1mg／mL)、中(O．5mg／mL)、高(1mg／mL)中药天门冬。培养7d、14d后，经4％多聚甲醛固定，行NSE免疫细胞化学鉴定。
1．5 免疫细胞化学染色及结果判定
    PBS洗后．0．2％Triton—1O0破膜10min；3%H2O2灭活内源性过氧化物酶活性10min；血清封闭20min；一抗(Nestinl：400；NSE 1：200)4C孵育过夜；滴加生物素化二抗20min；滴加SABC复合物，DAB显色。对照染色用PBS代替一抗。NSE免疫细胞化学中，每孔盖玻片随机选取2个视野，在1O0倍镜下计数单位视野阳性细胞数，所得数据用(X±S)表示，用SPSS统计学软件处理，采用方差分析与q检验，p< 0．05有显著性差异。
2  结果
2．1 细胞培养观察
    原代培养3d后，培养液中可见悬浮状态的数个到数十个细胞组成的细胞群落，多呈褐色，边界清楚，折光性强，边缘可见较小毛刺，称“神经球”。荧光染色显示Nestin阳性。贴壁培养的各组细胞中，细胞团在贴壁24h后就可明显观察到细胞团中细胞自细胞团向外伸出突起。加人中药天门冬水提液后，随着时间的推移，神经球内细胞逐渐向外迁出，相互之间形成网络联系。各试验组镜下单位视野内神经元样细胞均多于对照组。
2．2 免疫细胞化学染色结果
    本实验用神经元特异烯醇化酶(NSE)标记神经元，经SABC免疫组织化学试剂盒染色，神经元样细胞呈棕黄色，镜下见两个时间点各试验组细胞胞体、突起均较对照组发达。细胞计数结果见表1：在7d、l4d两个时间点，低、中、高剂量组NSE阳性细胞数与对照组比较，有显著性差异(P< 0．01)；各试验组间比较，有显著性差异( < 0．05)。实验结果说明，天门冬能促进神经干细胞向神经元方向分化，且存在着一定的量效依赖关系。

表1 NSC分化为NSE阳性细胞（X±S，个细胞／视野，n=6)
组别                 7d              14d
对照组           14.86±1.12     17.96±2.06
低剂量天门冬组   20.36±1.75n    26.48±1.72 n
中剂量天门冬组   21.96±1.46n    31.16±1.64 n
高剂量天门冬组   25.80±1.57n    32.63±1.73 n
F                   42.51            91.96

    经方差分析，F值分别为42．5l，91．76．对照组比较。n P< 0．O1，组间比较，有显著性差异(P< 0．05)。
3  讨论
    神经干细胞的定向分化研究，国内外大部分集中于细胞因子对神经干细胞的研究，利用传统中药对干细胞分化的研究较少。单纯的培养液使神经干细胞分化为神经元样细胞很少，而大部分向神经胶质样细胞分化。本实验各试验组促进神经干细胞分化为神经元的数量均高于对照组，无疑是天门冬发挥的药理作用。天门冬为传统中药，《本草经》列为上品，称其“久服轻身益气延年”[1]；相信古人是把天门冬作为抗衰老服用的；金元以前，人们普遍认为现代之脑血管病偏瘫为外感风寒所致，如《金匮要略》：“夫风之为病，当半身不遂……”[2]《本草经》主治“暴风湿偏痹”，提示人们曾使用天门冬治疗偏瘫。但后世天门冬多用于润肺止咳，唯近代中西医汇通代表张锡纯认为其能“流通血脉，畅达经络”，并在其治疗中风(急性脑血管病)名方“镇肝熄风汤”中使用本药[3]，现代药理研究亦证实其具抗血栓作用[4,5]。天门冬的确切药物机制还有待深入研究，目前文献表明可能与天门冬多糖有清除自由基及抗脂质过氧化活性从而改善机体抗氧化能力作用有关。首先，在神经元的整个生命过程中，自由基反应和脂质过氧化反应持续发生，使神经组织受到损害。实验研究表明，天门冬乙醇提取液可显著提高衰老模型小鼠脑超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、Na+、K+—ATP酶(Na+、K+—ATPase)活力，降低MDA含量(P< 0．O1)；可显著提高肝细胞膜Na+、K+—ATP酶(Na+、K+—ATPase)活力，降低MDA 含量(P<0．01)；可显著提高辜丸线粒体谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)、Na+、K+—ATPase活力(P< 0．01)，降低MDA含量(p<0．05)[6]提示其有清除自由基及抗脂质过氧化活性作用；其次，NO—氧化氮(NO)作为中枢神经系统神经递质，广泛参与神经细胞的存活、分化和可塑性的发生，而天门冬水提液及其纳米中药均能显著增强小鼠血清中NOS(P< 0．01)，提高NOS含量(P< 0．05)，降低LPF含量(P< 0．05)[7]，提示天门冬具有促进神经干细胞分化的可能性。本实验也证明了天门冬确实能够促进神经干细胞向神经元方向分化，这一结果为天门冬治疗神经系统疾病提供了实验依据。
参考文献：
[1]曹元字辑注．本草经[M]．上海：上海科学技术出版杜．1987，63—64
[2]金匮要略讲义．中风历节病脉证并治[M]．上海：上海科学技术出版社，1988，57—58
[3]张锡纯．医学衷中参西录[M]．石家庄：河北人民出版社，1987．27，111—1l2
[4]张明发，沈雅琴．朱自平，等．辛温(热)合归脾胃经中药药性研究(VI)抗血栓形成和抗凝作用[J]．中国中药杂志，l997，22(11)：691-693
[5]张小丽，谢人明．冯英菊．四种中药对血小板聚集性的影响[J]．西北药学杂志，2000，l5(6)：260—261
[6]曲风玉，魏晓东，李士莉，等．天门冬醇提液对衰老模型小鼠抗衰老作用的实验研究[J]．中医药学报．1999．(2)：68—70
[7]赵玉佳，孟祥丽．李秀玲，等．天门冬水提液及其纳米中药对衰老模型小鼠NOS、NO、LPF的影响[J]．中国野生植物资源，2005，24(3)：49-51