杨 云 ， 王 爽， 冯云霞， 董诚明， 冯卫生

摘要
背景： 滋补中药黄精的主要有效成分是糖类化合物，炮制加工使黄精中多糖含量降低，而小分子糖类含量增加。为分析小分子糖与黄精补益作用的相关性，课题组对此开展实验。
目的： 观察黄精中小分子糖对正常小鼠及对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠免疫功能的影响。
设计、时间及地点： 完全随机分组设计、对照实验，于2008-02/05在河南中医学院动物实验中心完成。
材料： 选取昆明种小鼠180只，100只用于正常小鼠实验，80只用于环磷酰胺致免疫功能低下小鼠实验。
方法： ① 正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验及溶血素、溶血空斑实验： 各选用5 0只小鼠，按随机数字表法分为5组，每组10只，各用药组分别灌服0.9 ，0.6 ， 0.3 g /kg的黄精小分子糖水溶液及阳性对照0.1g/kg的香菇多糖混悬液，空白对照组灌服同体积的生理盐水。② 环磷酰胺致免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验及溶血素、溶血空斑实验：各选用40只小鼠，按随机数字表法分为4 组，即模型组、空白对照组、香菇多糖片0.1 g/kg组、0.9 g/k g黄精小分子糖组，每组1 0只。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致小鼠免疫抑制模型。
主要观察指标： 观察各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数及溶血素、溶血空斑的形成情况。
结果： O.9 ， 0.6 g/kg小分子糖均能显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率及腹腔巨噬细胞的吞噬指数(P <0.01 )，促进小鼠溶血素和溶血空斑形成(P < 0.01 )， 以0.9 g/kg黄精小分子糖组作用为最优。0.9 g/kg小分子糖和香菇多糖片可显著提高免疫低下模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率(P < 0.01 ).且以0.9 g /kg小分子糖组效果明显； 0.9 g /kg小分子糖组可显著促进模型组小鼠溶血素和溶血空斑的形成(P < 0.01 )。
结论： 黄精小分子糖对机体免疫功能具有一定的增强作用，以剂量0.9 g/kg作用为最优。
关键词： 黄精小分子糖；环磷酰胺；免疫作用；小鼠

0 引言
    黄精为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生草本植物的干燥根茎，味甘，性平，无毒，是中国传统的中药，也是药食同源性中草药。2005版《中国药典》收载了黄精Polygonatum sibiricun Red 、囊丝黄精(多花黄精)Polygo natum cyrtonema Hua．或滇黄精Polygonatum kingianun Coll．et hemsl.的干燥根茎入药[1]，在民间同属其他一些植物的根茎也被当作黄精使用。黄精的现代研究主要集中在黄精多糖和皂苷的化学与药理活性方面[2-15]，关于黄精中小分子糖的研究，已有炮制加工对其含量的影响和糖分解产物的分析[16-17]，但未见其药理活性报道。针对以上空缺， 文章对黄精小分子糖的免疫作用进行了相关实验。
1 材料和方法
设计： 完全随机分组设计，对照实验。  
时间及地点： 于2008- 02 /05 在河南中医学院动物实验中心完成。
材料： 选用体质量18～22g的昆明种小鼠，雌雄各半，由郑州大学医学院动物实验中心提供(合格证号：豫医动字410115)。实验过程中对动物处置方法符合科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[18]。
  主要仪器、药品及试剂                来源
Uv-2000型紫外可见分光光度计   尤尼科上海仪器有限公司
玻璃匀浆器                    上海锐聪科技发展有限公司
xsP-44x.9型多用途生物显微镜   北京北科恒信科学器材有限公司
黄精药材                      河南省洛阳市栾川伏牛山区
无水葡萄糖                    天津市科密欧化学试剂开发中心
黄酒                          濮阳亚光制药厂， 酒精度≥1 2 ％
快速瑞士染液(批号：0507011)   迈克科技有限公司
香菇多糖(批号：070601)        湖北迪晨药业有限公司
环磷酰胺(批号：07040421)      江苏恒瑞医药股份有限公司
枸橼酸钠(批号：030925)        武汉市中天化工有限责任公司
硫酸铜(批号：831208)          郑州化学试剂厂
次甲基蓝(批号：051026)        天津市凯通化学试剂有限公司
酒石酸钾钠(批号：060504)      天津市福晨化学试剂厂
亚铁氰化钾(批号：810202)      北京化工厂

方法：
    黄精小分子糖的制备： 取净黄精3kg，加600g黄酒，置不锈钢锅中炖制25h， 即得酒炖黄精样品。将样品干燥、粉碎、过筛， 取酒炖黄精粉末，分别加10倍、7倍量体积分数为80%的乙醇超声2次，30min/次，过滤，合并滤液，减压回收滤液至无醇味，蒸馏水定容至3000mL，过滤。滤液过D101大孔吸附树脂柱，收集水洗液，浓缩至干， 得小分子糖。经HPLC检识，说明该样品中主要含有果糖、葡萄糖、蔗糖等多种小分子糖。
    黄精小分子糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响： 取小鼠50只，按随机数字表法分为5组，每组10 只，0.9，0.6，0.3 g/kg黄精小分子糖组、香菇多糖组及空白对照组分别灌服0.045，0.03，0.015g/mL的黄精小分子糖水溶液(2 0mL/kg) 、0．005g/mL的香菇多糖混悬液(20mL/kg)及同体积的生理盐水(20mL/k g)每天给药1次，连续给药12d 。第12天早上各组小鼠均腹腔注射50g/L鸡红细胞生理盐水混悬液0.5mL，于第12天灌胃给药后2h ，给鸡红细胞后4 h ，麻醉后脱颈椎处死小鼠。按文献[19-20]的方法进行实验，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
    黄精小分子糖对正常小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响：小鼠分组及给药途径同黄精小分子糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响的实验。于给药第5天各组小鼠均腹腔注射50g/L鸡红细胞生理盐水混悬液0.2mL/只，进行免疫，于最后1次给药后2h ，小鼠眼眶取血，3500r/min离心10min，分离血清。按文献[19 - 20]的方法进行实验，并测定各组溶血素形成情况。眼眶取血后的小鼠，麻醉后脱颈椎处死，解剖小鼠，也按文献[19—20]的方法进行实验，并测定各组溶血空斑形成情况。
    黄精小分子糖对免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响： 取小鼠40 只，按随机数字表法分为4 组，每组10只，0．9 g/kg黄精小分子糖组及香菇多糖组分别灌服0.045g/mL的黄精小分子糖水溶液(20 mL/ kg)和0.005g/mL的香菇多糖混悬液(20mL/kg)，模型组及空白对照组分别灌服同体积的生理盐水(20 m L/kg )每天给药1 次，连续给药15d 。于给药第11天0．9g/kg黄精小分子糖组、香菇多糖组及模型组腹腔注射环磷酰胺40mg/(kg?d )，连续给药5d 。第15天早上各组小鼠均腹腔注射50g/L鸡红细胞生理盐水混悬液0.5mL ，于第15天灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，麻醉后脱颈椎处死小鼠。按文献[21]的方法进行实验， 并计算吞噬百分率和吞噬指数。
    黄精小分子糖对免疫低下小鼠溶血素及溶血空斑形成的影响： 小鼠分组及给药途径同黄精小分子糖对免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响的实验。于给药第5 天各组小鼠均腹腔注射50g/L鸡红细胞生理盐水混悬液0.2mL/只进行免疫，于最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，3500 r/min离心10 min，分离血清。按文献[21]的方法进行实验，并测定各组溶血素形成情况。眼眶取血后的小鼠， 麻醉后脱颈椎处死，解剖，按文献[21]的方法进行实验，并测定各组溶血空斑形成情况。
设计、实施、评估者：实验设计、实施及评估为全部作者，均受过正规培训，未采用盲法评估。
统计学分析：由第三作者采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，计量资料数据用 X±S表示，组间比较采用t检验。

2  结果
2.1  实验动物数量分析  实验共选取昆明种小鼠180只，分别用于正常小鼠和环磷酰胺致免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验、溶血素及溶血空斑形成实验，每项实验小鼠均进入结果分析，无脱失。
2.2  黄精小分子糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响  见表1
表1  各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能比较
Table 1 Peritoneal macrophages phagocytic function among all groups
                                                     (X±S,n=10)
Group                                    Phagocytic Percentage(%)   Phagocyticindex
Blank control                                   61.4±9.5             0.69±0.08
0.1g/kg Xianggu Duotang                         78.2±6.0a            0.98±0.10a
0.9g/kg low molecular weight sacchairide        87.9±6.2a            2.37±0.11a
0.6g/kg low molecular weight sacchairide        83.7±4.9a            1.19±0.14a
0.3g/kg low molecular weight sacchairide        78.4±5.4a            1.06±0.07a
ap<0.01,vs.black control group
    从表1可以看出，与空白对照组相比，0.9，0.6，0.3g/kg小分子糖组均能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率及腹腔巨噬细胞的吞噬指数（P<0.01），以0.9g/kg小分子糖组作用为强。
2．3  黄精小分子糖对正常小鼠溶血素、溶血空斑形成的影响  见表2
表2  各组小鼠溶血素、溶血空斑形成情况比较
Table2  Hemolysin and hemolytic plaque formation
                                                     (X±S,n=10,A)
Group                                       hemolytic formation hemolytic plaque formation
Blank control                                   0.051±0.012               0.198±0.009
0.1g/kg Xianggu Duotang                           0.053±0.009               0.235±0.10a
0.9g/kg low molecular weight sacchairide   0.102±0.008a               0.270±0.010a
0.6g/kg low molecular weight sacchairide   0.073±0.007a               0.235±0.003a
0.3g/kg low molecular weight sacchairide   0.053±0.008               0.215±0.006a
ap<0.01,vs.black control group
    从表2可以看出，与黑白对照组相比，0.9，0.6g/kg小分子糖组溶血素和溶血空斑A值均显著升高（P<0.01），0.3g/kg小分子糖组和香菇多糖组溶血空斑A值显著升高（P<0.01），说明0.9，0.6g/kg小分子糖均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑形成，以0.9g/kg黄精小分子糖组作用为最优。

2.4  黄精小分子糖对环磷酰胺致免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响  见表3。
表3  各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能比较
Table3  Peritoneal macrophages phagocytic formation
                                                     (X±S,n=10,A)
Group phagocytic                                Peritoneal(%)     Phagocytic index
Blank control                                    61.4±9.5a        0.69±0.010a
Model                                            42.8±5.3         0.38±0.05
0.1g/kg Xianggu Duotang                          68.6±3.4a        0.74±0.08a
0.9g/kg low molecular weight sacchairide         70.7±4.0a        0.83±0.07a
^ap<0.01,vs.black control group
    从表3可以看出，与空白对照组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低（P<0.01），说明成功建立免疫抑制模型。与模型组相比，0.9g/kg小分子糖组和香菇多糖片组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低（P<0.01），且以0.9g/kg小分子糖组效果明显。

2.5  黄精小分子糖对环磷酰胺致免疫抑制小鼠溶血素、溶血空斑形成的影响  见表4。
表4  各组小鼠溶血素、溶血空斑形成情况比较
Table2  Hemolysin and hemolytic plaque formation
                                                     (X±S,n=10,A)

Group                                       hemolytic formation     hemolytic plaque formation
Blank control                                  0.056±0.029              0.274±0.023
0.1g/kg Xianggu Duotang                        0.041±0.013              0.342±0.036a
0.9g/kg low molecular weight sacchairide       0.114±0.027a             0.356±0.019a
Model 0.040±0.015 a 0.234±0.021a
^ap<0.01,vs.black control group
    从表4可以看出，与空白对照组相比，模型组溶血素、溶血空斑A值均显著降低（P<0.05），说明造免疫抑制模型成功。与模型组相比，0.9g/kg小分子糖组可显著促进小鼠溶血素、溶血空斑的形成（P<0.01），香菇多糖组可显著促进小鼠溶血空斑的形成，其A值显著升高（P<0.01），

3  讨论
    黄精含有多种类型的化学成分，如皂甙、黄酮、糖类、生物碱等，可利用各类成分溶解度的规律进行提取和分离纯化。在黄精小分子糖的制备中，采用体积分数为80%的乙醇提出小分子糖类，将多糖留在药渣中，醇提液浓缩后通过大孔吸附树脂，以水为溶剂洗脱出小分子糖，将皂苷和黄酮等成分留在树脂中，达到了分离纯化的目的。
    环磷酰胺是细胞毒性药物，能杀死有丝分裂和进入循环周期的细胞，具有较强的免疫抑制作用，在免疫学研究中，常以环磷酰胺作为免疫抑制模型的制备药物。黄精是中医传统的补虚药物，具有补肾益精、滋阴润燥的功效。现代医学认为，传统的滋补药物多数可以通过调节人体的免疫功能而达到防病治病的作用， 糖类化合物则是补虚药物中增强机体免疫力的主要活性部位。
    实验结果提示，黄精小分子糖能显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数(P < 0．01)以及促进溶血素和溶血空斑的形成；对环磷酰胺致免疫抑制小鼠的实验表明，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数、溶血素和溶血空斑的形成均显著降低，说明造免疫抑制模型成功。0．9g/kg黄精小分子糖组和香菇多糖片组的吞噬百分率和吞噬指数显著高于模型组(P<0．01) ， 且以0．9g/kg黄精小分子糖组效果明显；0．9g/kg黄精小分子糖组的溶血素和溶血空白斑的形成也显著高于模型组(p<0．01)，说明黄精中小分子糖具有促进小鼠非特异性免疫的作用，可增强小鼠体液免疫功能，并呈明显的量效关系。这为进一步阐明黄精的补肾益精、滋阴润燥等功效提供了实验依据，也提示黄精中小分子糖可能是一较好的免疫调节剂，值得进一步研究和开发。

4 参考文献
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